鱼类神经坏死病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

【产品名称】 鱼类神经坏死病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

【包装规格】 50T/盒

【货号】 ORS2659RT-T

【产品简介】

本试剂盒采用RT-PCR技术，针对鱼类神经坏死病毒的基因高度保守区域设计特异性引物，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据鱼类神经坏死病毒基因组高度保守区设计，不会跟其他生物RNA发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。

6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7. 本产品只能用于科研。

【试剂组成】

注意：

1) 高浓度标准品用于制备绝对定量的标准曲线，但易污染检测样本，需要在远离样本的区域用带滤芯的枪头稀释。

2) 不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

3) 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

4) 自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。

5) 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

6) 禁止与其他品牌/自配的试剂混用，否则会影响使用效果。

【储存条件及有效期】

1. 应置于-20℃以下冷冻避光贮存，有效期为12个月，详见外包装标签。

2. 采用泡沫盒加冰密封进行运输，温度不超过8℃。

3. 开封后各组分-20℃以下冷冻避光贮存，试剂现配现用。

【适用仪器】

ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【注意事项】

l 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。正式实验前选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。

l 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

l 静止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

l 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

l 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

l 避免皮肤或粘膜与试剂接触。实验完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

【样本采集及存放】

1. 样品采集

1) 根据实际情况采样，具体参考《临床微生物样本采集规范》。建议用成品的RNA提取试剂盒提取 RNA核酸样本。

2) 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

2. 保存与运输

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月。

运输：采集的样品密封后，采用样品箱加冰密封，并在规定温度下的保存期内送达实验室。严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

核酸提取请参照相关商品RNA提取试剂盒说明书进行操作即可。

2. 稀释标准曲线样品（以1E4-1E8拷贝/μL这5个10倍稀释度为例）

由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。

2.1 标记5个离心管，分别为7，6，5，4。

2.2 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同。

2.3 在7号管中加入5 μL1E8拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，吹打混匀，得1E7拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.4 换枪头，在6号管中加入5 μL1E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.5 换枪头，在5号管中加入5 μL1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.6 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。

若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1E6拷贝/μL即可。

3. Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行，冰上操作）

3.1 从-20℃以下冰箱中取出试剂盒，在室温融化后置于冰上。待完全溶解后上下颠倒轻轻混匀（请不要使用振荡器进行混匀），尽量避免出现泡沫并低速离心10s。

3.2 根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份），每测试反应体系配制如下表：

根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装18 μL反应混合液，盖上管盖后将PCR反应管转移至样本处理区。

3.3 加样（在样本处理区进行）

将制备的核酸样本、阳性对照各取2 μL分别加入PCR管中，盖好管盖，低速离心30秒后立即进行PCR扩增反应。

注意：每孔反应液中RNA模板量小于200 ng。

将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。

4. 上机检测（在检测区进行）

将PCR反应管放入荧光PCR检测仪内，按照下表设置核酸扩增相关参数，选择FAM荧光通道。

推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果判断

当同时满足以下条件时可判定试验成立，否则试验无效：

阳性对照：FAM通道Ct值≤35；

阴性对照：FAM通道无Ct值或Ct值＞35。

5.2 检测结果

(1) 进行定量检测时，需以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA拷贝数浓度的log值，再推算出其拷贝数浓度。

(2) 进行定性检测时：Ct值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出鱼类神经坏死病毒，结果为阳性；Ct值>40或无Ct值，表明样本中未检测出鱼类神经坏死病毒，结果为阴性；Ct值在38-40范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct值仍在38-40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行， 以免交叉污染；

实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。