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| 商品重量: | 0克 |
| 名称: | 牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒-ROX通道 |
| 货号: | ORS2649RT-T |
| 储存条件: | -20℃以下冷冻避光贮存 |
| 有效期: | 12个月 |
牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒-ROX通道
商品编号：ORS2649RT-T
- 产品简介
- 引用文献
- 实验方案
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产品名称:
牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒-ROX通道
商品货号:
ORS2649RT-T
名称:
牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒-ROX通道
货号:
ORS2649RT-T
储存条件:
-20℃以下冷冻避光贮存
有效期:
12个月
货品计量单位:
盒
主要用途:
该产品仅供科研使用，说明书以实际到货说明书为准！
供货周期:
1-5天
牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒（ROX通道）
【产品名称】 牛病毒性腹泻病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒（ROX通道）
【包装规格】 50T/盒
【货号】 ORS2649RT-T
【产品简介】
牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV)属于黄病毒科瘟病毒属，是球状的单股正链RNA病毒，基因组全长约12.5 kb。牛病毒性腹泻病毒感染后可引起多种不同的临床症状，包括腹泻、流产、免疫抑制等，给牛养殖业造成了严重的经济损失。因此快速检测牛病毒性腹泻病毒具有重要意义。
【试剂组成】
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成分
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编号
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规格
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酶混合液
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试剂一
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500 µL×1 管
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PCR反应液
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试剂二
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400µL×1 管
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模板稀释液
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试剂三
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1 mL×1 管
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高浓度标准品
（107copies/μL）
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试剂四
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50 µL×1 管
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说明书
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1份
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注意：高浓度标准品用于制备绝对定量的标准曲线，但易污染检测样本，需要在远离样本的区域
用带滤芯的枪头先稀释成103 copies/μL，方可作为阳性对照使用。
【储存条件及有效期】
-20℃, 避光保存、运输、反复冻融少于7次，有效期12个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR检测仪。
【样本采集及存放】
1 样本采集
1.1 工具
棉拭子、一次性无菌注射器、剪刀、镊子、研钵、1.5 mL离心管、移液器吸头、药匙。所有上述取样工具应经121℃，15min高压灭菌并烘干；1.5 mL 离心管、吸头应无DNA酶污染。
1.2 采样方法
拭子样品：鼻拭子采样，采样时要将灭菌处理过的拭子深入鼻腔来回刮3次~5次，取鼻腔分泌液。
肛门拭子：将灭菌处理过的拭子深入肛门转一圈蘸取粪便。粪便采样用高压过的药匙取新鲜的粪便，往往为稀便或血便。组织样品：组织样品采集时应采取有明显病变组织，编号备用。
2 存放与运送
采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用样品箱加冰密封，尽快运送到实验室。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 RNA提取
1 核酸提取请参照相关商品RNA提取试剂盒说明书进行操作即可。
2. 稀释标准曲线样品（以1E2-1E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
2.1 标记5个离心管，分别为6，5，4，3，2。
2.2 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同。
2.3 在6号管中加入5 μL1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，吹打混匀，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
2.4 换枪头，在5号管中加入5 μL1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
2.5 换枪头，在4号管中加入5 μL1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
2.6 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。
若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1E5拷贝/μL即可。
3. Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行，冰上操作）
3.1 从-20℃以下冰箱中取出试剂盒，在室温融化后置于冰上。待完全溶解后上下颠倒轻轻混匀（请不要使用振荡器进行混匀），尽量避免出现泡沫并低速离心10s。
3.2 根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份），每测试反应体系配制如下表：
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试剂
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酶混合液
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PCR反应液
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用量(样本数为N)
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10 μL
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8 μL
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根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装18 μL反应混合液，盖上管盖后将PCR反应管转移至样本处理区。
3.3 加样（在样本处理区进行）
将制备的核酸样本、阳性对照（105 copies/μL）各取2 μL分别加入PCR管中，盖好管盖，低速离心30秒后立即进行PCR扩增反应。
注意：每孔反应液中RNA模板量小于200 ng。
将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。
4. 上机检测（在检测区进行）
将PCR反应管放入荧光PCR检测仪内，按照下表设置核酸扩增相关参数，选择ROX荧光通道。
推荐循环参数设置：
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阶段
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循环数
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温度
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时间
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ROX荧光信号采集
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反转录
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1×
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42℃
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30 min
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否
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预变性
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1×
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95℃
|
5 min
|
否
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变性
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40×
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95℃
|
15 s
|
否
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退火/延伸
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55℃
|
40 s
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是
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5. 结果分析判定
5.1 结果判断
当同时满足以下条件时可判定试验成立，否则试验无效：
阳性对照：FAM通道Ct值≤35；
阴性对照：FAM通道无Ct值或Ct值＞35。
5.2 检测结果
(1) 进行定量检测时，需以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA拷贝数浓度的log值，再推算出其拷贝数浓度。
(2) 进行定性检测时：Ct值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出牛病毒性腹泻病毒，结果为阳性；Ct值>40或无Ct值，表明样本中未检测出牛病毒性腹泻病毒，结果为阴性；Ct值在38-40范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct值仍在38-40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
【注意事项】
所有操作严格按照说明书进行；
试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
加样时应使样品落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖；
反应液应避光保存；
反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行， 以免交叉污染；
实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【检测方法的局限性】
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
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实验方案
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