澳睿赛生物生产的 ELISA 试剂盒采用“夹心法 ”:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标 准品中的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SABC 复合物与生物素化检测抗体结  合，形成免疫复合物，加入 TMB 显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液变黄  色，检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm 处测OD 值，靶蛋白浓度与OD 值之 间呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度。

按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB 底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液 液体变为黄色后进行吸光度值测定。

双抗体夹心模式图

试剂盒组分:(保存温度4℃)

实验所需材料

酶标仪，包含450nm测定波长，建议配置包含600-680nm校正波长，采用双波长检测；

移液器及枪头、蒸馏水或去离子水、计量器具、带刻度的烧杯、量筒等耗材和容器具；

水平轨道微孔板振荡器、计时器、瓶、排枪或微孔板洗板机等辅助；

用于稀释校准品和样品的离心管、干净的吸水纸、以及其他实验可能需要用到的器具；

标本收集及试剂准备:

1、样品预处理

下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般性指导。样品稳定性尚未评估。

a) 细胞培养上清液：在 1000×g 下离心 15 分钟去除颗粒，立即进行测定或等分装样品，并 将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。（细胞培养上清液样品建议 2 倍稀 释。例如：100 μL 样品+100 μL 的 1×稀释液） 

b) 血清：使用血清分离管，使样品在室温下凝结 30 分钟，然后在 1000×g 下离心 15 分钟。 立即取出血清并进行测定或等分装样品，将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融 循环。（血清样品建议 2 倍稀释。例如：50 μL 样品+50 μL 的 1×稀释液）

c) 血浆：使用EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。收集后 30 分钟内，以 1000×g 离心 15 分 钟。立即测定或等分装样品，并将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。

（血浆样品建议 2 倍稀释。例如：50μL 样品+50 μL 的 1×稀释液）注：柠檬酸盐抗凝剂 血浆未经验证可用于本试验，使用时应自行验证可行性。溶血的样品不适合用于该测定。

d) 组织匀浆：用预冷的 PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞 会影响检测结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1:9 的 重量体积比，比如 1g 的组织样品对应9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨或 匀浆机研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最 后将匀浆液于 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。

e) 细胞裂解液：贴壁细胞用预冷 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟 后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷 PBS 清洗 3 次，每 1×106 个 细胞中加入 150-200 μL 的 PBS 重悬（推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适 当减少 PBS 体积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于 2-8℃ , 1500×g 离心10 分钟，取上清检测。

f) 其它样本类型：1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测。

2、洗涤液/稀释液配置

如果洗涤液/稀释液（20×) 有晶体析出，需在 37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水 1:20 稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液/稀释液加入 19mL 的蒸馏水）

3、标准品配置

取 8 个 1.5ml 离心管，分别标注 S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7，blank，第一管 S1 中加入标准品/样品稀释液900ul，第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液 200ul，在第一管中加入标准品溶液（20000pg/ml）100ul 置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出 200ul，移至第二管，如此反复作对倍稀释至 S7，第八管为空白对照。配置好的标准曲线浓度为:2000、1000、500、 250、125、62.5、31.25、0pg/ml（标准品的用量及标准曲线范围也可根据自己需要配置）。

4、生物素化抗体工作液配置

使用前 20 分钟，用生物素化抗体稀释液将 100×生物素化抗体稀释成 1×工作液，根据所需 用量配置，当日使用，剩余弃之。

5、SABC 工作液配置

使用前 20 分钟，用 SABC 稀释液将 100×SABC 稀释成 1×工作液，根据所需用量配置，当日 使用，剩余弃之

6、如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适 当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

检测程序:

1. 加样：空白孔加入 100 μ l 标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品 100ul， 将反应板混匀后置 37℃ , 60 分钟。

2. 洗板：用 1×洗涤液将反应板充分洗涤 3 次，每孔加入 1×洗液 300 μ l，每次震荡/浸泡 1-2 分钟，向滤纸上印干。

3. 空白孔加入 100ul标准品/样品稀释液，其余孔各加入 1×的生物素化抗体工作液 100ul， 混匀后置 37℃ , 60 分钟。

4. 洗板：同上。

5. 每孔加入 SABC 工作液 100ul，混匀后置 37℃ , 30 分钟。

6. 洗板：同上。

7. 每孔加入 TMB 显色底物 100ul，混匀后置 37 ℃暗处反应 10-20 分钟（具体显色时间根据 显色结果而定）。

8. 每孔加入 50ul 终止液，混匀，5 分钟内用酶标仪在 450nm 处测吸光值。

结果判断和计算

1. 所有 OD 值建议减除空白孔值后再进行计算，如空白孔 OD 低于0.1，也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品 OD 值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。