一、样本制备问题

1. 抗原丢失或弱信号

   • 可能原因：

     • 固定不及时（组织未立即固定导致抗原降解）。

     • 固定时间过长（如福尔马林固定超过24小时）。

     • 抗原修复方法不当（未选择合适的热修复或酶修复）。

   • 解决办法：

     • 新鲜组织立即固定（推荐4%多聚甲醛固定6-24小时）。

     • 优化抗原修复方法（尝试不同pH值的修复液，如pH6.0或pH9.0的EDTA或柠檬酸盐缓冲液）。

     • 使用高压修复或微波修复增强抗原暴露。

2. 组织切片脱落

   • 可能原因：

     • 载玻片未包被（如未使用多聚赖氨酸或APES处理的玻片）。

     • 组织脱水不彻底或切片过厚。

   • 解决办法：

     • 使用防脱玻片，并在切片前彻底干燥。

     • 优化脱水梯度（乙醇浓度逐步升高）。

二、抗体相关问题

3. 非特异性染色（背景高）

   • 可能原因：

     • 一抗或二抗浓度过高。

     • 封闭不充分（如BSA或血清封闭时间不足）。

     • 抗体交叉反应（抗体与无关抗原结合）。

   • 解决办法：

     • 优化抗体浓度（通过预实验梯度稀释确定最佳浓度）。

     • 延长封闭时间（推荐5% BSA或同源血清封闭30-60分钟）。

     • 使用高特异性单克隆抗体或预吸附抗体。

4. 信号弱或无信号

   • 可能原因：

     • 一抗效价低或失效（保存不当导致抗体降解）。

     • 抗原修复不彻底。

     • 显色时间不足或显色剂失效。

   • 解决办法：

     • 验证抗体有效性（阳性对照实验）。

     • 调整抗原修复条件（延长修复时间或提高温度）。

     • 延长显色时间（DAB显色时监控颜色变化，避免过度）。

三、染色与显色问题

5. 染色过深或过浅

   • 可能原因：

     • DAB显色时间控制不当。

     • 一抗孵育时间过长或过短。

   • 解决办法：

     • 显色时镜下实时观察，及时终止反应（流水冲洗）。

     • 优化孵育时间（一抗通常4℃过夜或室温1小时）。

6. 非特异性颗粒沉积

   • 可能原因：

     • 内源性过氧化物酶未阻断（如红细胞或某些组织中的酶）。

     • 试剂污染或结晶。

   • 解决办法：

     • 使用3% H₂O₂甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶（10-30分钟）。

     • 过滤试剂或更换新鲜试剂。

四、对照与结果分析问题

7. 阴性对照出现阳性信号

   • 可能原因：

     • 二抗非特异性结合。

     • 自发荧光（荧光IHC中常见）。

   • 解决办法：

     • 增加二抗对照（不加一抗，仅加二抗）。

     • 使用抗荧光淬灭封片剂，避光保存样本。

8. 阳性对照不显色

   • 可能原因：

     • 实验系统故障（如显色剂失效、抗体失活）。

   • 解决办法：

     • 检查试剂有效期，更换新批次试剂。

     • 确认操作步骤无误（如是否漏加抗体）。

五、其他常见问题

9. 细胞形态破坏

   • 可能原因：

     • 固定时间过长或固定液浓度过高。

     • 高温修复导致组织损伤。

   • 解决办法：

     • 缩短固定时间，优化抗原修复温度（避免沸腾）。

10. 复染效果差

    • 可能原因：

      • 苏木素过度染色或分化不足。

    • 解决办法：

      • 控制复染时间（苏木素染色1-3分钟），充分分化（1%盐酸酒精）。